离子交换层析的原理(关于离子交换填料的选择,看这一篇就够啦~)

离子交换层析的原理。更多关注公号：环保水处理（hbscl01）

离子交换层析是目前功能最强大，应用最广泛的层析方式。随着科技的发展进步，Cytiva的离子交换填料也在不断推陈出新，面对名目繁多的产品，到底该如何快速选择适合自己的填料呢？

本篇将教大家如何识他们的本质，快速锁定合适的产品。

离子交换填料的选择，一般遵循以下四个步骤

离子交换的原理

离子交换层析是根据样品在特定 pH 值的 buffer 中所带电荷的差异，对物质进行分离的一种层析技术。样品所处 buffer 的 pH 值低于其等电点 pI 时，样品带正电，可以与阳离子交换填料上带负电的配基结合；所处 buffer 的 pH 值高于其等电点 pI 时，样品带负电，可以与阴离子交换填料上带正电的配基结合。

对某种样品而言，buffer 的 pH 值与分离方式和效果的关系可通过下图来直观地感受：

因此对某种样品而言，其适合的离子交换方式与所用的 buffer 的 pH 值息息相关。

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确定离子交换方式

样品一般在中性 pH 值的环境中保持较好的活性，在进行离子交换层析时，所用 buffer 的 pH 值需偏离样品等电点 1 个 pH 值以上。在交换方式的确定环节，常规选择目标物质结合到填料上，而杂质流穿的模式，洗脱时收集目标物。但也可以选择目标物质为不结合填料的流穿模式，使杂质结合到填料上，同样可以达到目标物质与杂质分离的目的。

所用 buffer pH 值高于样品等电点时，样品带负电，一般用阴离子交换的方式进行物质的分离；所用 buffer 的 pH 值低于样品的等电点时，样品带正电，一般用阳离子交换的方式进行物质的分离。

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选择配基

离子交换填料由基架和配基组成，填料的性质主要由配基决定。目前Cytiva的离子交换填料上偶联的配基一共有 6 种。

阳离子交换配基：SP（强阳）、S（强阳）、CM（弱阳）；

阴离子交换配基：Q（强阴）、DEAE（弱阴）、ANX（弱阴）。

离子交换填料的配基类型

注：一般首选强的离子交换配基，比如 Q，SP 等。如果样品和待分离物等电点差异较小，可以选择弱的离子交换配基，这样在洗脱电导发生改变的时候，样品与填料的结合力会发生比较明显的改变，从而可以更好地分离结合力（带电量）差异不明显的物质。

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选择基架

基架的主要差别在于填料粒径大小，从而提供流速和分辨率的差异。离子交换填料基架包括以下三种：

交联琼脂糖基架：

Sepharose 4FF：4% 的交联琼脂糖，提高分子量大于 650KDa 蛋白的结合载量；

Sepharose XL：6% 的交联琼脂糖加葡聚糖链形成基架，配基偶联在葡聚糖链上，载量提高；

Sepharose Big Beads：粒径 100-300um，用于捕获阶段粗样品的提取，尤其适合比较粘稠的样品。

高流速琼脂糖基架：

由高度交联的高流速琼脂糖作为基架，表面为线状葡聚糖链，刚性更强，传质速度更快。配基结合在线状葡聚糖链上，因此拥有比传统 Sepharose 填料高出一倍的动态载量，需要的保留时间大大缩短（图 A）。Capto 在高流速时仍然可以保持较低的背景压，因此可以使用更高的工作流速（图 B）。

多模式离子交换填料：除了以上普通的离子交换填料外，Cytiva还推出了多模式离子交换填料。这类填料有两种配基—弱阳离子配基 MMC 和强阴离子配基 adhere，分别偶联到粒径为 75μm 和 40μm 的基架上，其中 40μm 的 ImpRes 系列分辨率更高。多模式填料结构和可提供的作用力如下：

Capto MMC & Capto MMC ImpRes：

多模式弱阳离子交换填料，具有离子、疏水、嗜硫亲和和氢键作用等多种作用力。其疏水作用力使该填料在高电导情况下仍能保持理想的动态载量，尤其适合用于需高电导上样的大体积样品的捕获。

Capto adhere & Capto Adhere ImpRes：

多模式强阴离子填料，高特异性的 Adhere 配基能一步将内毒素、DNA、聚集体、protein A、HCP 去除，使得抗体纯化两步法平台工艺的实现成为可能。

至此，离子交换填料家族成员全部集齐，

其阵容如下：

04

根据纯化步骤选择合适的填料

因填料耐受的最大流速不同，分辨率和载量均有差异，同时样品体积和纯度在各纯化步骤中千差万别，需要结合具体的纯化步骤选择合适的填料。

1) 捕获

快速富集目的蛋白，将其从大量的杂质或关键污染物如蛋白酶和糖苷酶中分离出来，载量和速度是该步骤的首要考虑因素。该步骤可以使用的离子交换填料类型是 Sepharose FF、Capto、Sepharose XL、Sepharose Big Beads。如果纯化的样品在 mg 级别且后期没有放大需求，可以用 SOURCE 和 Sepharose HP 填料。

2) 中度纯化

去除蛋白、核酸、内毒素和病毒等明显的杂质，重点考虑载量和分辨率。可用填料类型：Sepharose HP、Capto ImpAct、Capto ImpRes、SOURCE 15 、SOURCE 30、Sepharose FF。如果纯化的样品在 mg 级别且后期没有放大需求，可以用 MonoBeads。

3) 精纯

去除痕量杂质，如异构体、核酸、病毒和内毒素等，使目的样品达到应用级别，在这个环节中分辨率最重要。这个步骤可用填料：MonoBeads、SOURCE 15&SOURCE 30、Capto ImpAct、Capto ImpRes和 Capto Hires。

理清以上思路后可以根据样品体积、稳定性等，结合填料载量选出合适的填料及产品类型。

注意事项

选好产品后，在实际的使用中还需要注意以下几个方面：

上样前需将样品置换到平衡缓冲液中，在样品体积相对柱体积来说较大时，这一点尤其重要；

柱子载量和要达到的分辨率决定上样量。如果想达到最好的分辨率，建议上样量为柱子载量的 30%；

实际载量受样品大小和形状的影响，同时填料孔径，流速，样品浓度，pH/蛋白带电性、离子强度等均会影响载量；

添加合适的去垢剂：添加离子型去垢剂时，应避免加入的去垢剂与填料配基结合而影响填料的结合载量。

**文章图文来源Cytiva